Izolowanie klonu
Zasadniczo klonowanie przeprowadza się w celu uzyskania klonu jednego konkretnego interesującego genu lub sekwencji DNA. Dlatego następnym krokiem po klonowaniu jest znalezienie i wyizolowanie tego klonu wśród innych członków biblioteki. Jeśli biblioteka obejmuje cały genom organizmu, to gdzieś w tej bibliotece będzie pożądany klon. Istnieje kilka sposobów jego znalezienia, w zależności od konkretnego genu, którego dotyczy problem. Najczęściej sklonowany segment DNA, który wykazuje homologię do poszukiwanego genu, jest używany jako sonda. Na przykład, jeśli gen myszy został już sklonowany, wówczas klon ten można wykorzystać do znalezienia równoważnego ludzkiego klonu z ludzkiej biblioteki genomowej. Kolonie bakteryjne tworzące bibliotekę hoduje się w kolekcji płytek Petriego. Następnie porowatą membranę nakłada się na powierzchnię każdej płytki, a komórki przylegają do membrany. Komórki są zrywane, a DNA dzieli się na pojedyncze pasma - wszystko na błonie. Sonda jest również podzielona na pojedyncze pasma i znakowana, często radioaktywnym fosforem. Następnie stosuje się roztwór sondy radioaktywnej do kąpania błony. Jednoniciowy DNA sondy przylega tylko do DNA klonu zawierającego równoważny gen. Membranę suszy się i umieszcza na arkuszu filmu wrażliwego na promieniowanie, a gdzieś na filmach pojawi się czarna plama, oznajmiająca obecność i lokalizację pożądanego klonu. Klon można następnie odzyskać z oryginalnych płytek Petriego.
genetyka: technologia rekombinacji DNA i reakcja łańcuchowa polimerazy
Postęp techniczny odegrał ważną rolę w rozwoju zrozumienia genetycznego. W 1970 r. Amerykańscy mikrobiologowie Daniel Nathans
sekwencjonowanie DNA
Po sklonowaniu segmentu DNA można określić jego sekwencję nukleotydową. Sekwencja nukleotydowa jest najbardziej podstawowym poziomem wiedzy na temat genu lub genomu. Jest to plan zawierający instrukcje budowy organizmu i żadne zrozumienie funkcji genetycznej lub ewolucji nie byłoby kompletne bez uzyskania tych informacji.
Używa
Znajomość sekwencji segmentu DNA ma wiele zastosowań, a kilka przykładów podano poniżej. Po pierwsze, można go użyć do znalezienia genów, segmentów DNA, które kodują określone białko lub fenotyp. Jeśli region DNA został zsekwencjonowany, można go przeszukać pod kątem charakterystycznych cech genów. Na przykład, otwarte ramki odczytu (ORF) - długie sekwencje, które zaczynają się od kodonu start (trzy sąsiadujące nukleotydy; sekwencja kodonu dyktuje produkcję aminokwasów) i są nieprzerwane przez kodony stop (z wyjątkiem jednej na ich końcu) - sugerują region kodujący białko. Ponadto, ludzkie geny na ogół sąsiadują z tak zwanymi wyspami CpG - skupiskami cytozyny i guaniny, dwóch nukleotydów tworzących DNA. Jeśli wiadomo, że gen o znanym fenotypie (taki jak gen choroby u ludzi) znajduje się w sekwencjonowanym regionie chromosomalnym, wówczas nieprzypisane geny w regionie staną się kandydatami na tę funkcję. Po drugie, homologiczne sekwencje DNA różnych organizmów można porównać w celu wykreślenia zależności ewolucyjnych zarówno w obrębie gatunku, jak i pomiędzy gatunkami. Po trzecie, sekwencję genową można przeszukiwać pod kątem regionów funkcjonalnych. W celu określenia funkcji genu można zidentyfikować różne domeny, które są wspólne dla białek o podobnej funkcji. Na przykład pewne sekwencje aminokwasowe w obrębie genu zawsze znajdują się w białkach obejmujących błonę komórkową; takie odcinki aminokwasów nazywane są domenami transbłonowymi. Jeśli domena transbłonowa zostanie znaleziona w genie o nieznanej funkcji, sugeruje to, że kodowane białko znajduje się w błonie komórkowej. Inne domeny charakteryzują białka wiążące DNA. Wszystkie publiczne bazy danych sekwencji DNA są dostępne do analizy dla każdej zainteresowanej osoby.
![Film „Smak miodu” Richardsona [1961]](https://images.thetopknowledge.com/img/entertainment-pop-culture/4/taste-honey-film-richardson-1961.jpg "Film „Smak miodu” Richardsona [1961]")
